消毒工藝對水體中抗生素抗性基因的去除效果 2018-03-19
抗生素及其殘留會引發抗生素抗性基因污染。抗生素抗性基因被視為一種新型的環境污染物，在環境科研領域受到廣泛關注，其分布情況和傳播機制成為現今研究的焦點。通過總結水環境中抗生素抗性細菌和抗性基因的分布以及消毒工藝對抗生素抗性基因的去除效果，認為氯消毒相對其他消毒方法在去除抗生素抗性基因中更經濟可行，且消毒處理可以影響抗性基因的接合轉移率，從而對抗性基因的水平轉移起到抑制作用，并可能進一步影響到抗生素抗性基因的傳播和擴散。
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)是能對抗生素產生抗性的基因，是微生物，包括病原微生物，耐藥性形成和擴散的物質基礎，是一類新型環境污染物。它能在微生物包括病原微生物間傳播，還可從細菌、人類散播源和動物源等傳播擴散到自然環境和飲用水系統中。甚至ARGs能通過攜帶抗性基因的質粒等可移動遺傳元件進入人體，致使抗生素療效下降，細菌感染的治療更加棘手。有報道世界上每年因抗結核桿菌受影響人數達50萬，歐盟每年約2.5萬人死于感染多重抗性細菌，美國每年約6.3萬人死于醫院獲得性細菌感染。目前臨床上使用的所有抗生素幾乎都存在其抗性細菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)，甚至出現“超級細菌”，如“新德里.梅塔洛一號”(New Delhi-Metallo-1, NDM-1)。因此，ARGs極可能引發公共健康危機。
環境中ARGs主要產生于醫療和畜牧業長期濫用或誤用抗生素，從而使水體、土壤、活性污泥等環境介質成為ARB或ARGs的源和匯。目前，已有大量報道在水環境、土壤、沉積物中檢測到ARGs，甚至空氣中也檢測到ARGs。這些ARGs可持久存在于環境中，并且在攜帶ARGs的微生物死亡后，釋放到環境中的裸露的DNA分子最終又可通過基因重組轉入其它微生物而使其具有抗性，給人類和動物安全帶來潛在威脅。特別是水環境已成為ARGs散播的重要介質，也是ARGs的重要貯存庫之一。本文闡述了ARGs在水環境中的分布，總結了目前水處理工藝中消毒對ARGs的去除效果，并探討了消毒處理對其傳播擴散的影響機制。
1 ARGs在水環境中的分布及傳播擴散
ARGs和ARB已被證明在地表水、市政污水、污水處理廠出水以及飲用水中普遍存在，且種類繁多，迄今已在各種水體中檢測出上百種ARGs。例如在北美、歐洲、東亞和東南亞等地區的9個國家的飲用水、海水、地表水、醫療廢水、化糞池及污水處理廠檢測出大環內酯類(如aphA1、aphA2、aadA1)、磺胺類(如dfrA12、dfrA17、sulI)、βu內酰胺類(如blaTEM-1、blaOXA-1、blaPSE-1)、四環素類(如tetA、tetH、tetJ、tetY、tetZ)、青霉素類(如mecA、penA)和大環內酯類(如ermA、mphA)等多達50種ARGs(表1)。一般認為水環境中的這些ARGs主要通過醫療和水產養殖廢水直接進入地表水體，也可由糞便施肥使其先進入到土壤環境，再隨雨水等地表徑流滲透到地下水中。因此，ARGs在水環境中廣泛分布，特別是污水處理廠，由于含抗生素和ARB的廢水直接排入其中而富集大量ARGs，成為ARGs集聚和傳播的一個重要媒介。如Su等從污水廠分離到的98.4%的菌株對檢測的抗生素具有抗性，90.6%的菌株至少對3種抗生素表現出抗性。水體環境中這些ARB和ARGs的存在不僅會威脅到飲用水安全，也可能影響到水資源的循環利用。研究發現，用淡水和處理后廢水灌溉過的土壤均檢測出高水平的抗生素抗性。可見，水環境中ARGs普遍存在且可能對人類健康和環境生態帶來影響。
ARGs主要通過垂直基因轉移(vertical gene transfer, VGT)和水平基因轉移(horizontal gene transfer, HGT)兩種方式進行傳播擴散。垂直基因轉移是依靠微生物親代之間的分裂生殖進行;水平基因轉移則是ARGs通過接合 (conjugation) 、轉化 (transformation ) 、轉導(transduction) 、轉座以及細菌溶源性基因轉移等過程發生轉移，從而使另一菌株獲得抗性的過程，它是水體環境中ARGs轉移擴散的重要方式。早在20世紀40年代就有微生物水平基因轉移的描述，并提出HGT的發生是由選擇性壓力和生物進化產生的一種普遍現象。如有研究發現攜帶四環素類抗性基因的質粒在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和氣單胞菌(Aeromonas spp.)之間進行轉移，另外，還觀察到耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)間抗性基因轉移現象。其中，HGT對ARGs通過水傳微生物進行傳播擴散起到重要作用。正是由于水平基因轉移的存在致使 ARGs不僅可以在水體環境中從親代傳遞給子代，還可以在同種屬或不同種屬微生物間進行基因傳遞。甚至在細菌、真菌、病毒和真核生物基因組均觀察到基因的水平轉移。因此，水體環境中ARGs的存在及其通過水傳微生物的轉移擴散給人體健康和水的生物安全性帶來隱患。
ARGs作為新型的環境污染物在水環境中可通過水傳微生物進行散播。研究發現，在水處理過程中水傳微生物攜帶ARGs不僅會使水體中ARGs的濃度增加,還可能進入到水源水和給水系統。Zhang等已在飲用水系統中廣泛檢測到ARB和ARGs，也有報道在大型給水廠中檢測到9個種或屬的 ARGs且出現較高豐度。而參與城市水循環的地表水更是擴散致病微生物和ARGs的重要載體之一。因此，如何有效去除和控制水環境中的ARGs需要重點關注。而消毒是殺滅水中對人體健康有害的致病微生物的重要方式，可防止通過飲用水傳播疾病。也是生活飲用水安全、衛生的最后保障。特別是氯消毒因其具有經濟和高效的特性，因而被廣泛應用于廢水和飲用水消毒。
2 消毒對ARGs和(或)ARB豐度的影響
消毒通常可以降低出水中的細菌總量，從而對ARGs的削減起到一定作用。但對ARGs的去除效果還會受消毒方式等影響。目前，國內外使用的消毒方法包括化學消毒法(如鹵素消毒劑、臭氧和過氧乙酸等)、物理消毒法(如膜過濾截留微生物)和光化學消毒法(如紫外線)以及電化學消毒法。廣泛應用的主要有氯消毒、二氧化氯消毒、臭氧殺菌和紫外線照射及氧化消毒等，盡管這些消毒方法一般都能在水處理過程中去除部分ARB或ARGs，但在污水處理廠的出水中它們的檢出率仍然較高，且相對總量和種類在出水中變化不大(表2)，甚至出現ARGs相對豐度升高現象。例如氧化和UV消毒對ARGs的去除幾乎沒有效果，對少數ARGs去除率能達到1~2個數量級，但氯消毒對ARGs的去除可以達到2~3個數量級，而消化處理、人工濕地及其它非消毒處理對ARGs的去除最多達到1個數量級。
由于 ARGs的去除率不僅受消毒方法的影響，還會受到細菌攜帶抗性類型、消毒劑量和多種消毒方法結合使用等多種因素影響，因此很難明顯降低或徹底清除ARGs污染。如Xu等用高通量定量PCR檢測不同水處理工藝的給水廠出水時發現兩給水處理廠經消毒處理的出水中ARGs的相對豐度都提高了。因為一般的給水廠或污水廠處理過程基本沒有專門針對去除ARGs而設計的工藝，且水體中ARGs的含量還可能受補給、水量、季節變化、用途及流經地區等因素影響，因此物理法、化學法和生物法對ARGs的去除效果并不明顯。由于目前消毒工藝對ARB和ARGs的控制效應數據也還較少，所以難以提出較有效的方法和途徑來遏制ARGs的散播。
表 2 不同處理方法對ARB、ARGs的去除效果
3 消毒對ARGs水平轉移的影響機制
消毒可對細菌的接合效率產生作用而影響到ARGs水平轉移。如Guo等發現低UV劑量(達到8 mJ/cm2)對接合轉移頻率能產生影響，但影響很小，而低氯消毒劑量(達到 40 mg Cl min/L)能明顯提高接合轉移的頻率2到5倍，同時發現高劑量的UV(>10 mJ/cm2)或氯消毒(>80 mg Cl min/L)下ARGs轉移的頻率均相對降低。Lin 等也對UV和氯處理對ARGs的轉移率進行了研究，發現UV和低水平氯消毒處理都能降低接合效率。表現為當UV劑量(5~20 mJ/cm2)逐漸增加時，轉移率逐漸降低，而氯消毒處理時，轉移率沒有變化(氯劑量為0.05~0.2 mg/L)或轉移率較低甚至低于檢出限(氯劑量為0.3~0.5 mg/L)。可見，UV和氯劑量較低對ARGs的水平轉移幾乎沒有影響，當UV劑量在10~20 mJ/cm2隨著劑量的增加能使ARGs的轉移率逐漸降低。
消毒對ARGs水平轉移影響的具體機制有：一是通過降低供體細菌的存活率，從而降低接合轉移率;二是使細胞滲透性發生變化。研究發現氯消毒產生的氯胺能刺激細菌改變細胞滲透性，使接合細胞的表面會出現更多的菌毛，提高ARGs的接合轉移率，從而促進ARGs的水平基因轉移;三是抑制相關轉移基因的表達。如在較低余氯(0.05~0.2 mg/L)可能對鞭毛基因( flagellar gene，flgC)、膜外蛋白基因(an outer membrane porin gene, ompF)和DNA轉移相關的基因( a DNA transport-related gene, traG)的表達產生抑制，從而降低水平基因轉移率;四是通過集聚不同質粒、插入序列和整合子，從而提高ARGs水平基因轉移的發生。如Shi等在給水廠發現ampC、aphA2、blaTEM-1、tetA、tetG、ermA和ermB基因氯消毒后發生了富集，并通過宏基因組分析認為飲用水氯化處理確實能富集多種ARGs，同時質粒、插入序列和整合子等與ARGs的水平轉移相關的可移動遺傳元件也會發生集聚。可見，消毒處理時消毒劑的類型及劑量對ARGs的水平轉移能起到促進作用也可能產生抑制，同時，消毒時間也會對其產生影響。并且，消毒處理對ARGs和可移動遺傳元件的富集作用也能進一步促進ARGs的水平基因轉移。
4 總結與展望
研究發現，ARGs污染通過HGT進行傳播擴散對我們人類和動物的影響甚至遠遠超過抗生素殘留本身產生的影響。因為基因污染不同于一般環境污染物，其具有遺傳性且一旦散播到環境中難以控制和消除，對人類和生態環境的影響將是長期的和不可逆的。因此，如何有效預防和降低其轉移擴散帶來的環境影響是一項重要課題。本文分析了水環境中ARGs的廣泛分布，指出水體已成為ARGs匯聚和擴散的重要介質，發現消毒在水處理中對ARGs的去除能起到一定作用，但效果不明顯，甚至會出現消毒處理后ARGs相對豐度升高現象，即消毒能降低ARGs的絕對量，但相對豐度會增加。并認為消毒能通過影響細菌的接合效率、使細胞滲透性發生變化和抑制相關轉移基因的表達以及對ARGs和可移動遺傳元件富集而對ARGs的水平轉移產生作用。表現為UV劑量低于20 mJ/cm2時，對ARGs的水平轉移影響較小，甚至出現降低水平基因轉移率;而氯消毒劑量達到40~80 mg Cl min/L時，能對ARGs的水平轉移起到促進作用。
目前，針對水環境中ARGs的去除，較多已有的研究只是檢測水環境中消毒后ARB或ARGs的豐度變化，很少報道消毒對水環境中ARGs去除影響的具體機制。雖然也有關于多種消毒方法對ARGs去除的對比及機制探討，但還是難以很好揭示水中較高的ARB或ARGs比例，特別是在實際消毒過程中消毒及其副產物對ARGs的作用規律仍需進一步探究。另外，對于不同環境介質中ARB、ARGs及可移動遺傳元件的檢測與表征大體包括傳統微生物培養法和分子生物學方法，但相關采樣、數據分析和結果表達等需要進一步建立和完善，使其更加標準化和系統化，也方便在不同方法和實驗室條件下對所得研究結果進行比較。
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)是能對抗生素產生抗性的基因，是微生物，包括病原微生物，耐藥性形成和擴散的物質基礎，是一類新型環境污染物。它能在微生物包括病原微生物間傳播，還可從細菌、人類散播源和動物源等傳播擴散到自然環境和飲用水系統中。甚至ARGs能通過攜帶抗性基因的質粒等可移動遺傳元件進入人體，致使抗生素療效下降，細菌感染的治療更加棘手。有報道世界上每年因抗結核桿菌受影響人數達50萬，歐盟每年約2.5萬人死于感染多重抗性細菌，美國每年約6.3萬人死于醫院獲得性細菌感染。目前臨床上使用的所有抗生素幾乎都存在其抗性細菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)，甚至出現“超級細菌”，如“新德里.梅塔洛一號”(New Delhi-Metallo-1, NDM-1)。因此，ARGs極可能引發公共健康危機。
環境中ARGs主要產生于醫療和畜牧業長期濫用或誤用抗生素，從而使水體、土壤、活性污泥等環境介質成為ARB或ARGs的源和匯。目前，已有大量報道在水環境、土壤、沉積物中檢測到ARGs，甚至空氣中也檢測到ARGs。這些ARGs可持久存在于環境中，并且在攜帶ARGs的微生物死亡后，釋放到環境中的裸露的DNA分子最終又可通過基因重組轉入其它微生物而使其具有抗性，給人類和動物安全帶來潛在威脅。特別是水環境已成為ARGs散播的重要介質，也是ARGs的重要貯存庫之一。本文闡述了ARGs在水環境中的分布，總結了目前水處理工藝中消毒對ARGs的去除效果，并探討了消毒處理對其傳播擴散的影響機制。
1 ARGs在水環境中的分布及傳播擴散
ARGs和ARB已被證明在地表水、市政污水、污水處理廠出水以及飲用水中普遍存在，且種類繁多，迄今已在各種水體中檢測出上百種ARGs。例如在北美、歐洲、東亞和東南亞等地區的9個國家的飲用水、海水、地表水、醫療廢水、化糞池及污水處理廠檢測出大環內酯類(如aphA1、aphA2、aadA1)、磺胺類(如dfrA12、dfrA17、sulI)、βu內酰胺類(如blaTEM-1、blaOXA-1、blaPSE-1)、四環素類(如tetA、tetH、tetJ、tetY、tetZ)、青霉素類(如mecA、penA)和大環內酯類(如ermA、mphA)等多達50種ARGs(表1)。一般認為水環境中的這些ARGs主要通過醫療和水產養殖廢水直接進入地表水體，也可由糞便施肥使其先進入到土壤環境，再隨雨水等地表徑流滲透到地下水中。因此，ARGs在水環境中廣泛分布，特別是污水處理廠，由于含抗生素和ARB的廢水直接排入其中而富集大量ARGs，成為ARGs集聚和傳播的一個重要媒介。如Su等從污水廠分離到的98.4%的菌株對檢測的抗生素具有抗性，90.6%的菌株至少對3種抗生素表現出抗性。水體環境中這些ARB和ARGs的存在不僅會威脅到飲用水安全，也可能影響到水資源的循環利用。研究發現，用淡水和處理后廢水灌溉過的土壤均檢測出高水平的抗生素抗性。可見，水環境中ARGs普遍存在且可能對人類健康和環境生態帶來影響。
ARGs主要通過垂直基因轉移(vertical gene transfer, VGT)和水平基因轉移(horizontal gene transfer, HGT)兩種方式進行傳播擴散。垂直基因轉移是依靠微生物親代之間的分裂生殖進行;水平基因轉移則是ARGs通過接合 (conjugation) 、轉化 (transformation ) 、轉導(transduction) 、轉座以及細菌溶源性基因轉移等過程發生轉移，從而使另一菌株獲得抗性的過程，它是水體環境中ARGs轉移擴散的重要方式。早在20世紀40年代就有微生物水平基因轉移的描述，并提出HGT的發生是由選擇性壓力和生物進化產生的一種普遍現象。如有研究發現攜帶四環素類抗性基因的質粒在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和氣單胞菌(Aeromonas spp.)之間進行轉移，另外，還觀察到耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)間抗性基因轉移現象。其中，HGT對ARGs通過水傳微生物進行傳播擴散起到重要作用。正是由于水平基因轉移的存在致使 ARGs不僅可以在水體環境中從親代傳遞給子代，還可以在同種屬或不同種屬微生物間進行基因傳遞。甚至在細菌、真菌、病毒和真核生物基因組均觀察到基因的水平轉移。因此，水體環境中ARGs的存在及其通過水傳微生物的轉移擴散給人體健康和水的生物安全性帶來隱患。
ARGs作為新型的環境污染物在水環境中可通過水傳微生物進行散播。研究發現，在水處理過程中水傳微生物攜帶ARGs不僅會使水體中ARGs的濃度增加,還可能進入到水源水和給水系統。Zhang等已在飲用水系統中廣泛檢測到ARB和ARGs，也有報道在大型給水廠中檢測到9個種或屬的 ARGs且出現較高豐度。而參與城市水循環的地表水更是擴散致病微生物和ARGs的重要載體之一。因此，如何有效去除和控制水環境中的ARGs需要重點關注。而消毒是殺滅水中對人體健康有害的致病微生物的重要方式，可防止通過飲用水傳播疾病。也是生活飲用水安全、衛生的最后保障。特別是氯消毒因其具有經濟和高效的特性，因而被廣泛應用于廢水和飲用水消毒。
2 消毒對ARGs和(或)ARB豐度的影響
消毒通常可以降低出水中的細菌總量，從而對ARGs的削減起到一定作用。但對ARGs的去除效果還會受消毒方式等影響。目前，國內外使用的消毒方法包括化學消毒法(如鹵素消毒劑、臭氧和過氧乙酸等)、物理消毒法(如膜過濾截留微生物)和光化學消毒法(如紫外線)以及電化學消毒法。廣泛應用的主要有氯消毒、二氧化氯消毒、臭氧殺菌和紫外線照射及氧化消毒等，盡管這些消毒方法一般都能在水處理過程中去除部分ARB或ARGs，但在污水處理廠的出水中它們的檢出率仍然較高，且相對總量和種類在出水中變化不大(表2)，甚至出現ARGs相對豐度升高現象。例如氧化和UV消毒對ARGs的去除幾乎沒有效果，對少數ARGs去除率能達到1~2個數量級，但氯消毒對ARGs的去除可以達到2~3個數量級，而消化處理、人工濕地及其它非消毒處理對ARGs的去除最多達到1個數量級。
由于 ARGs的去除率不僅受消毒方法的影響，還會受到細菌攜帶抗性類型、消毒劑量和多種消毒方法結合使用等多種因素影響，因此很難明顯降低或徹底清除ARGs污染。如Xu等用高通量定量PCR檢測不同水處理工藝的給水廠出水時發現兩給水處理廠經消毒處理的出水中ARGs的相對豐度都提高了。因為一般的給水廠或污水廠處理過程基本沒有專門針對去除ARGs而設計的工藝，且水體中ARGs的含量還可能受補給、水量、季節變化、用途及流經地區等因素影響，因此物理法、化學法和生物法對ARGs的去除效果并不明顯。由于目前消毒工藝對ARB和ARGs的控制效應數據也還較少，所以難以提出較有效的方法和途徑來遏制ARGs的散播。
表 2 不同處理方法對ARB、ARGs的去除效果
3 消毒對ARGs水平轉移的影響機制
消毒可對細菌的接合效率產生作用而影響到ARGs水平轉移。如Guo等發現低UV劑量(達到8 mJ/cm2)對接合轉移頻率能產生影響，但影響很小，而低氯消毒劑量(達到 40 mg Cl min/L)能明顯提高接合轉移的頻率2到5倍，同時發現高劑量的UV(>10 mJ/cm2)或氯消毒(>80 mg Cl min/L)下ARGs轉移的頻率均相對降低。Lin 等也對UV和氯處理對ARGs的轉移率進行了研究，發現UV和低水平氯消毒處理都能降低接合效率。表現為當UV劑量(5~20 mJ/cm2)逐漸增加時，轉移率逐漸降低，而氯消毒處理時，轉移率沒有變化(氯劑量為0.05~0.2 mg/L)或轉移率較低甚至低于檢出限(氯劑量為0.3~0.5 mg/L)。可見，UV和氯劑量較低對ARGs的水平轉移幾乎沒有影響，當UV劑量在10~20 mJ/cm2隨著劑量的增加能使ARGs的轉移率逐漸降低。
消毒對ARGs水平轉移影響的具體機制有：一是通過降低供體細菌的存活率，從而降低接合轉移率;二是使細胞滲透性發生變化。研究發現氯消毒產生的氯胺能刺激細菌改變細胞滲透性，使接合細胞的表面會出現更多的菌毛，提高ARGs的接合轉移率，從而促進ARGs的水平基因轉移;三是抑制相關轉移基因的表達。如在較低余氯(0.05~0.2 mg/L)可能對鞭毛基因( flagellar gene，flgC)、膜外蛋白基因(an outer membrane porin gene, ompF)和DNA轉移相關的基因( a DNA transport-related gene, traG)的表達產生抑制，從而降低水平基因轉移率;四是通過集聚不同質粒、插入序列和整合子，從而提高ARGs水平基因轉移的發生。如Shi等在給水廠發現ampC、aphA2、blaTEM-1、tetA、tetG、ermA和ermB基因氯消毒后發生了富集，并通過宏基因組分析認為飲用水氯化處理確實能富集多種ARGs，同時質粒、插入序列和整合子等與ARGs的水平轉移相關的可移動遺傳元件也會發生集聚。可見，消毒處理時消毒劑的類型及劑量對ARGs的水平轉移能起到促進作用也可能產生抑制，同時，消毒時間也會對其產生影響。并且，消毒處理對ARGs和可移動遺傳元件的富集作用也能進一步促進ARGs的水平基因轉移。
4 總結與展望
研究發現，ARGs污染通過HGT進行傳播擴散對我們人類和動物的影響甚至遠遠超過抗生素殘留本身產生的影響。因為基因污染不同于一般環境污染物，其具有遺傳性且一旦散播到環境中難以控制和消除，對人類和生態環境的影響將是長期的和不可逆的。因此，如何有效預防和降低其轉移擴散帶來的環境影響是一項重要課題。本文分析了水環境中ARGs的廣泛分布，指出水體已成為ARGs匯聚和擴散的重要介質，發現消毒在水處理中對ARGs的去除能起到一定作用，但效果不明顯，甚至會出現消毒處理后ARGs相對豐度升高現象，即消毒能降低ARGs的絕對量，但相對豐度會增加。并認為消毒能通過影響細菌的接合效率、使細胞滲透性發生變化和抑制相關轉移基因的表達以及對ARGs和可移動遺傳元件富集而對ARGs的水平轉移產生作用。表現為UV劑量低于20 mJ/cm2時，對ARGs的水平轉移影響較小，甚至出現降低水平基因轉移率;而氯消毒劑量達到40~80 mg Cl min/L時，能對ARGs的水平轉移起到促進作用。
目前，針對水環境中ARGs的去除，較多已有的研究只是檢測水環境中消毒后ARB或ARGs的豐度變化，很少報道消毒對水環境中ARGs去除影響的具體機制。雖然也有關于多種消毒方法對ARGs去除的對比及機制探討，但還是難以很好揭示水中較高的ARB或ARGs比例，特別是在實際消毒過程中消毒及其副產物對ARGs的作用規律仍需進一步探究。另外，對于不同環境介質中ARB、ARGs及可移動遺傳元件的檢測與表征大體包括傳統微生物培養法和分子生物學方法，但相關采樣、數據分析和結果表達等需要進一步建立和完善，使其更加標準化和系統化，也方便在不同方法和實驗室條件下對所得研究結果進行比較。
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